莪术内生真菌的分离与鉴定

　　莪术(Curcuma ze&garia)是姜科姜黄属植物，其根茎及根产生的β-榄香烯是一种广谱、高选择性的抗癌药物。目前β-榄香烯提取自温郁金(c.wenyujin)根茎，工艺流程繁琐，成本高，有必要探索新的生产途径。近年来研究发现，内生真菌是植物微生态系统的重要组成部分，其中个别菌株能够产生与宿主相同或相似的活性代谢产物。本文首次对莪术根、根茎和块根内生真菌进行分离鉴定，为深入研究莪术内生真菌能否产生β-榄香烯类化合物提供实验材料。

　　1材料与方法

　　1.1材料：2～3年生莪术采自云南屏边县新现乡。

　　1.2培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、查氏培养基、促孢培养基(KH2P04lg，Mg-SO40.5g，KN031g，KCl0.5g，淀粉0.2g，葡萄糖0.2g，琼脂2g，水1000ml，pH自然)。

　　1.3莪术内生真菌的分离：新鲜莪术的根、根茎和块根用自来水洗净，消毒纸巾吸干水分。按常规无菌操作，75%酒精漂洗3～5min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干水分，0.1%升汞漂洗20～30s，无菌水冲洗5次。用无菌解剖刀将表面消毒的根、根茎和块根的韧皮部切成约0.5×0.5cm2小片，置于PDA平块上，28℃温箱培养3～7d。待样品边缘有菌丝长出，挑取菌丝尖端接种于新的PDA平板，经数次纯化后转接到PDA斜面上备用。同时做对照实验，将表面消毒后的根、根茎和块根不作切割置相同条件下培养，结果无任何微生物长出，证明表面消毒彻底，分离到的真菌是莪术的内生真菌。

　　1.4内生真菌的鉴定：挑取纯化的真菌菌丝分别接种于PDA和查氏培养基上，采用三点接种法培养后肉眼观察菌落特征，并采用插片培养法进行显微观察。对其中不产孢的菌株再用促孢培养基培养。参照文献鉴定真菌。

　　2　结果与讨论

　　2.1莪术内生真菌种属：从莪术根、根茎和块根中分离到24株内生真菌。经鉴定，分属表1中的8个属。其中青霉属16株，分离频率66.67%，为优势种群，镰孢属2株，分离频率8.33%，头孢霉属、曲霉属、无孢菌群、丝核菌属、壳变孢属及毛霉属各1株，分离频率均为4.17%。

　　2.2莪术内生真菌在植物器官中的分布：

　　从表2可以看出，莪术地下部分的不同部位都分离到内生真菌，说明内生真菌普遍存在于莪术地下器官中。但内生真菌在植物器官中的分布差异较大，寄生于根和根茎中的内生真菌种类和数量相对较多，青霉属(Peni.cilliurn)是其中的优势种群。

　　3　结论

　　分离到24株内生真菌，从分类上看，分属于5个目，5个科，8个属(群)：从内生真菌存在部位看，莪术地下器官中均有内生真菌，但内生真菌的数量和种类有明显差别。这些特点与生态系统中物种多样性是一致的。所分离到的内生真菌中，青霉属分离频率最高，是莪术内生真菌中的优势种群。

　　由于长期生存于植物细胞内或细胞间隙这一特殊环境，在协同进化的过程中，内生真菌与宿主植物相互影响，建立了和谐的联合关系，植物可能调节内生真菌的生物学特性，使内生真菌产生十分丰富的次生代谢产物。本研究分离到的24株内生真菌将为研究莪术内生真菌能否产生β-榄香烯等天然活性产物提供基础和依据。